1、組織的採集、固定和儲存：
採取組織後，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4°C 固定1小時（根據組織大小和緻密程度調整固定時間）或過夜
方法二：採用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 過夜（成年 tesis）
PBS緩衝液洗三次，每次5min，4°C保存於70%乙醇中。
2、組織的包埋、切片、展片及儲存：：
固定後的樣品經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，52-54°C石蠟包埋，常規切片，切片厚4 -10mm，貼於處理過的乾淨載玻片上，37°C烤片過夜，之後收集於載片盒中，RT密封儲存。
石蠟包埋：
保存於4°C 70%乙醇中的組織樣品
¯
80%乙醇 15 min
¯
95%乙醇 15 min
¯
100%乙醇 15min ´ 2
¯
1/2乙醇1/2二甲苯 15 min
¯
二甲苯透明 5-10 min
¯
1/2二甲苯1/2石蠟 30 min
¯
石蠟（1） 1。5hr
¯
石蠟（2） 1。5-2。5hr
¯
石蠟（3） 包埋
¯
RT儲存
3、石蠟組織切片的免疫組化方法：
密封保存於RT的組織切片
¯
二甲苯（1） 20 min
¯
二甲苯（2） 20 min
¯
100%乙醇 20min
¯
95%乙醇 10 min
¯
80%乙醇 10 min
¯
通風櫥晾乾，阻水筆在組織周圍畫圈
¯
切片在PBS中浸泡 5 min*2
¯
0。4%Tritonx RT 10 min
¯
切片在PBS中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT
10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0。25%胰酶
RT
10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer（3%BSA+5%NGS+0。2%Tritonx-100 in PBS）
RT 6
0min
傾去blocking buffer，勿洗
一抗4°C overnight in blocking buffer
取出切片復溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB顯色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
如果是增強型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS終止顯色，HE襯染1s，
玻片架放入泡沫盒，流水沖洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若顏色太深，可用0。1-0。5%鹽酸乙醇分色1～2秒鐘（或更久）
脫水85%乙醇 5 min
¯
95%乙醇 5 min
¯
無水乙醇 5 min
¯
無水乙醇 5min
¯
二甲苯（1） 10min
¯
二甲苯（2） 10min
¯
中性樹膠封片，室溫乾燥儲存
4、石蠟組織切片的免疫熒光方法：
密封保存於RT的組織切片
¯
二甲苯（1） 20 min
¯
二甲苯（2） 20 min
¯
100%乙醇 20min
¯
95%乙醇 10 min
¯
80%乙醇 10 min
¯
通風櫥晾乾，阻水筆在組織周圍畫圈
¯
切片在PBS中浸泡 5 min*2
¯
0。4%Tritonx RT 10 min
¯
切片在PBS中浸泡 5 min*3
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0。25%胰酶
RT
10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer（3%BSA+5%NGS+0。2%Tritonx-100 in PBS）
RT 6
0min
傾去blocking buffer，勿洗
一抗4°C overnight in blocking buffer
取出切片復溫1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
熒光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h
DAPI（1：1000請根據二抗說明稀釋二抗）
切片在PBS中浸泡 5 min*3moil封片，避光4°C儲存