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凱氏定氮法
原 理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然後加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機氮轉化為硫酸銨。鹼化蒸餾使氨遊離，用硼酸吸收後以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算係數，即為蛋白質的含量。
取 樣
由於食品種類繁多，形態及含氮量不一，因此取樣應均勻，稱樣量應準確合理。對取樣較困難的半固體（如冰淇淋）可置於已記重的紙片上稱重（樣品重=總重-紙片重） ，樣品稱好後，與紙片一起置於凱氏燒瓶底部。為減少系統誤差可於空凱氏燒瓶中同時投入相同規格的紙片一張同時作空白。對於不同含氮量的食品，為保證終點滴定消耗酸的體積數在有效範圍，取樣量應視樣品含氮量而定，-般含量在5 %~ 20 %的應精確稱取（1。0~2。0）g（如糕點等） ；對含量在0。1 %~ 1。0 %的應相應增大取樣量，以（5。0~ 10。0）g為宜（如澱粉等） ；對於高含量的（蛋白質大於30 %）的應減少取樣量，以（0。2~1。0）g為宜（如大豆粉等）。
樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質會分解為氨，然後氨與硫酸結合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來加快蛋白質分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點，一般情況下，純硫酸的沸點在340 ℃左右，但是在新增硫酸鉀後，可提高至400 ℃以上。提高溫度使有機物加快分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點的到達，有機物全部消化完全後，溶液呈現清澈的藍綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時鹼性反應的指示劑。
蒸 餾
消化液中的硫酸銨在鹼性環境下會轉化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測定結果，所以水蒸氣發生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強酸弱鹼鹽，需要足夠的鹼液使結合態的氨完全反應並釋放出來，這個過程中的氫氧化鈉一定要過量，過量的氫氧化鈉會與硫酸銅生成藍色的氫氧化銅沉澱，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉澱。檢驗蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4 或NH3遇奈氏試劑會反應生成棕紅色的碘化汞銨化合物。
吸 收
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時指示劑的變色反應。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
滴 定
待吸收完全後，用硫酸或者鹽酸標準溶液進行酸鹼滴定，滴定液的濃度直接影響結果的準確性，必須按照要求進行配製和標定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點時液體呈灰色。
注意事項
①所用的試劑溶液應用無氨蒸餾水配製；
②取樣應具有代表性，取樣前將樣品充分混勻；
③樣品稱量放入凱氏燒瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失；
④為了保證使燒瓶壁上的殘渣消化完全，在消化過程中要不時地轉動凱氏燒瓶；
⑤消化脂肪或糖含量較高的樣品時，易產生大量泡沫，為防止泡沫溢位，消化時應先消化加熱並不斷搖動，或者加入少量辛醇或液體石蠟或矽油消泡劑；
⑥當樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫後，再加入30%的過氧化氫，然後繼續加熱消化；
⑦加鹼後，漏斗要進行水封，避免因裝置漏氣造成氨的逸出影響結果的準確性；
⑧要保證蒸餾裝置不能漏氣；
⑨在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發生倒吸；
⑩蒸餾前如果加鹼後消化液呈藍色而沒有生成氫氧化銅沉澱，說明加入的鹼量不足，需要適量補加鹼；，蒸餾時為防止水蒸氣發生器內液體爆沸，加入幾片碎瓷片或大的玻璃珠，玻璃珠直徑最好大於聯通的玻璃管直徑，以免玻璃珠進入玻璃管內影響蒸汽均勻、充足的輸出；-冷凝管下端要插入硼酸吸收液液麵以下，防止氨逸出，蒸餾完畢後先將冷凝管下端提離液麵，再蒸1 min後清洗管口，再移開吸收瓶，最後關掉熱源，否則可能發生倒吸。
凱氏定氮法誤差分析
氮含量與蛋白質含量的折算：
蛋白質主要由氨基酸構成，不同種類氨基酸的氮含量不同，因此計算含氮量和蛋白質含量時需根據實際情況選取適當的折算係數，否則會帶來很大的誤差。例如，一-些小分子的氨基酸、鹼性氨基酸、氨基酸醯胺等氮元素的含量高於平均水平，如果待測樣品中這類的氨基酸含量較高，為測量的準確性需要調整折算係數，否則會導致計算結果比真實的含氮量高。在標準中給出測最時計算的表示式如式（1） ：
使用公式要根據待測樣品的種類選取合適的F值，具體取值情況如下： 一般食物F=6。25；純乳與純乳製品F=6。38；麵粉F=5。70；玉米、高粱F=6。24；花生F=5。46；大米F= 5。95；大豆及其粗加工製品F=5。71；大豆蛋白製品F=6。25；肉與肉製品F= 6。25；大麥、小米、燕麥、裸麥F=5。83；芝麻、向日葵F=5。30；複合配方食品F=6。25。
多次測量取平均值減小偶然誤差：
整個測量中涉及大量試劑的配製使用，操作與讀數，各種環境因素的干擾等，這些都會使測量中產生偶然誤差，因此在蛋白質含量的測量中，最終測量結果需要進行多次重複性試驗，並將得到的結果取算數平均值表示，以此減小測量的偶然誤差，並且如果待測樣品蛋白質的含量即：X≥1 g/100 g，其結果需要保留三位
有效數字：如果待測樣品蛋白質的含量即： X<1 g/100 g，其結果只需要保留兩位有效數字即可。
其他含氮物質的干擾：
透過凱氏定氮法的基本原理與操作步驟可發現，使用該方法檢測時，第一步消化的本質是將樣品中的氮元素全部轉化生成硫酸銨，即凱氏定氮法測量的是被測樣品中有機物中含有氮元素的總量，因此該辦法並無法消除樣品中其他有機物中含有的氮元素對測量結果的影響，如尿素、三聚氰胺等。當年三鹿公司使用的蛋白質檢測方法便為凱氏定氮法，最終未能檢測出原料中的三聚氰胺而導致食品安全事件。除去樣品中非蛋白質部分有機物中氮元素對整個測量的影響，要先去除非蛋白質中的氮元素再進行具體測量，或用其他方法測出非蛋白質中的氮含量，再用總氮含量減去該值再進行折算。
蛋白質純度測定
摘 要
本文圍繞蛋白質純度的重要性，闡述了蛋白類雜質的檢測方法，包括電泳法，色譜法，沉降速率測定法，質譜法，光散射法。任何方法都不能直接定量蛋白質樣品的純度。無論最終目的是為了解釋分析資料、驗證過程質量，還是為了確保生物製劑產品的安全性，樣品純度的測定都是至關重要的環節。
隨著蛋白類生物製品的發展，蛋白質純度已經成為藥品管理的重大問題。在生物製品的質量指導原則中指出：除了評價原料藥和藥物產品的純度，可能由預期產品和多種產品相關物質組成之外，還應評價可能出現的雜質成份。這些雜質可能是在生產過程中產生的或者是與產品相關，它們的結構可能是已知的、定性的，亦或是未知的。
在評價樣品純度之前，首先要鑑定待測雜質的型別，如核酸、碳水化合物、脂質、無關蛋白質、同工酶類、失活蛋白質，進而確定在待測溶液中，能夠區分假定雜質和目標蛋白質的理化性質（化學分析或物理特徵）。純化過程中可能已將某一雜質的濃度降低到檢測限以下，但色譜峰中還有殘留。毫無疑問，表觀純度取決於所選擇的測定方法及其靈敏度。大多數的分離方法都能有效的去除非蛋白類雜質，下面簡單介紹蛋白質樣品中蛋白類雜質的檢測方法。
01。電泳法
電泳法最簡單、成本最低，並且在確定樣品中蛋白質組分數目方面靈敏度最高，因此最為常見。通常被用於蛋白質純度鑑定的第一步篩選，甚至應用於初期高異質性的樣品鑑定。如果預期雜質與目標蛋白的分子量有差距，SDS凝膠電泳可以分辨出雜質。對於分子量相近但氨基酸組成不同的分子，SDS凝膠電泳一般分不開，但在非變性凝膠電泳中可以根據其不同的電泳遷移率進行鑑定。
然而，在採用該方法時也需要注意一些潛在的問題。對於變性凝膠，可能出現假陰性和假陽性現象。如果發生雜質共遷移或雜質無法進入凝膠的情況，會出現假陰性。因此應該將整塊膠，包括濃縮膠和分離膠都染色，並且需要檢驗蛋白質燃料是否合適。而假陽性的產生，可能是由於在樣品製備時發生共價修飾，或者膠不均一或氧化劑殘留。同時在非變性凝膠中也會出現類似問題。如果雜質的靜電荷為零或者與目標蛋白相反，雜質將不會出現在膠上，可以透過加寬非變性凝膠電泳的PH範圍來解決。
02。色譜法
2.1 凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法是檢測與目的蛋白分子量大小不同雜質的最簡單方法之一。此方法無破壞性並且非常快速。因為此方法為樣品區分法，樣品透過凝膠柱時會被稀釋，因此檢測的樣品需要有一定的起始濃度。而具體的檢測量則取決於檢測雜質時的靈敏度。
凝膠過濾色譜法檢測分子大小的靈敏度低於電泳法，實驗需要的材料量大於電泳法。由於凝膠過濾色譜通常在天然狀態下進行，結果可以反映樣品的異質性。但如果蛋白質以穩定的寡聚物形式存在（如脂肪酸酶），在凝膠過濾色譜時將表現出異質性。同時，快速、可逆自聯作用的蛋白質也會表現出異常濃度的洗脫譜。在出現這樣情況的時候，可以從不對稱或加寬峰中選取不同部分來重複凝膠過濾色譜。
2.2 反相高效液相色譜法
反相高效液相色譜法（reversed phase HPLC），是利用如改性矽介質等非極性基質作為固定相，透過流動相中的有機溶劑減少了蛋白質與固定相的親和力，進行極性遞減的梯度洗脫，從而將蛋白洗脫下來。
由於該方法簡單並且迅速，同時有現成的儀器裝置，能夠靈活應用於多種不同特性的蛋白質分離，因此此方法已普遍用於蛋白質樣品的純度測定。如果有需要，還可以透過改變流動相使樣品在不同梯度及條件下分離，來確定主要目標物的純度。
03。
沉降速率測定法
沉降速度法，能夠簡單並且快速非破壞性的來測定蛋白質的純度，同時對分子質量和分子大小的比值非常靈敏。該方法的優點在於，測定範圍非常的廣；但侷限在於，對相對分子質量相差小的樣品做測定時，靈敏度低於電泳技術。
04。質譜法
質譜法可以直接測定一個樣品中共價質量的分佈，此方法能夠方便簡便、靈敏的測定雜質。質譜法不僅可以檢測雜質的存在，還可以描述雜質的質量特徵，因此質譜法常被用於鑑定雜質的來源。透過串聯質譜法（MS/MS），可以鑑定共價改性修飾特徵和位點。由於雜質可能與主要目標物有相似的質荷比，將質譜法與其他方法（如凝膠分離色譜）聯用，可以增加樣品純度測定的準確性，達到最佳的效果。
05。光散射法
目前一些儀器能夠透過靜態或動態光散射來測定單個樣品，或者監測高效液相色譜和場級分離過程。透過對分子大小和表觀分子質量的連續測定，增強鑑定洗脫蛋白質的能力，以區分待分析物、待分析物的多聚體或雜質。光散射法非常簡單且無破壞性，同時能夠提供洗脫時間函式的分子質量圖。如果紫外檢測峰不對稱，透過多角度光散射（multiple angle light scattering，MALS）分析，有可能表現峰的主要部分表觀分子量為mol/L，而邊緣為2mol/L，說明可能存在二聚體。但出現倍數分子質量不一定能證明一定存在自身結合，還需要採用不同的方法驗證此結果。
結 論
任何方法都不能直接定量蛋白質樣品的純度。通常情況下，蛋白質純度測定涉及評價待定雜質的含量或僅僅驗證蛋白質樣品中是否存在雜質。無論最終目的是為了解釋分析資料、驗證過程質量，還是為了確保生物製劑產品的安全性，樣品純度的測定都是至關重要的環節。
本文整理自：
食品理化檢測
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