最近一直在做雙熒光素酶報告基因檢測，都已經一個多月了，熒光值偏低、轉染效率低、復孔重複性差……明明和師兄做的步驟一模一樣，為什麼結果卻相差這麼多？屁顛屁顛跑去問師兄，誰知他直接給了我一套實驗方案和常見問題分析答疑，受寵若驚，以後再也不用擔心實驗的問題啦。
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熒光素酶（Luciferase）
是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統稱，其中最具代表性的是螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase）。熒光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化過程中，會發出生物熒光，可透過熒光測定儀測定 luciferin 氧化過程中釋放的生物熒光。
雙熒光素酶報告基因檢測實驗
包括兩種熒光素酶，即螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶［1］。
這兩種熒光素酶作用方式不同。
一是底物和輔助因子不同，螢火蟲熒光素酶需要熒光素、O2、ATP 和 Mg2+，而海腎熒光素酶僅需要腔腸素（coelenterazine）和 O2。二是發光顏色不同，螢火蟲熒光素酶產生黃綠色光，發光波長為 560 nm；而海腎熒光素酶產生藍光，發光波長為 465 nm。
圖 1。 兩種熒光素酶檢測原理
實驗方案
藉助雙熒光素酶報告基因檢測實驗對啟動子結構進行分析驗證，可先對啟動子基本序列進行驗證，再對其核心區域進行驗證，實驗主要流程如下。
驗證啟動子序列
1、分析啟動子
根據已有資訊並利用各種生物資訊學線上軟體，初步確定目的基因啟動子可能所在位置。
2、構建載體
將預測序列構建到帶有報告基因的質粒上，構建表達載體。載體通常使用 pGL4。20 載體和 pRL 系列載體。
3、轉染表達
將所要檢測的質粒和帶有海腎熒光素酶基因的質粒轉染進入細胞內，擴增表達熒光素酶。
4、裂解檢測
加入細胞裂解緩衝液，添加發光底物，用熒光檢測儀或酶標儀進行檢測。
5、統計分析
藉助 GraphPad Prism5 等軟體進行繪圖，並分析實驗結果。
驗證啟動子核心區域
為尋找目的基因啟動子核心區域，首先分析目的基因啟動子區域的構成，將目的基因啟動子重要結構域進行缺失構建，接著將構建載體進行轉染表達，裂解檢測，最後對獲得資料進行統計分析，以此尋找驗證啟動子核心區域。
圖 2。 實驗基本技術路線
常見問題及解決方案（DL101）
Q1 熒光值低
可能原因及解決方案如下：
Q2 復孔重複性差
可能原因及解決方案如下：
（1）實驗平行復孔（不同細胞孔）：不同孔之間的數值影響因素較多。建議做同一個細胞孔裂解液的技術性平行來檢測試劑重複性。
（2）來源於同一個細胞孔的裂解液復孔：注意實驗操作、加樣順序、加樣速度及加樣量。檢查排槍加樣是否存在不均一問題。
（3）控制不同樣品和底物混合後至上機檢測的時間間隔儘量一致。
注：
熒光素酶報告基因實驗的檢測結果非常靈敏，復孔之間的數值有一定差異是正常的，一般認為在同一個數量級的差異是可以接受的。
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內容策劃：劉果
內容稽核：吳軍
題圖來源：站酷海洛
【參考文獻】
［1］。 盧昂。 Sipa1 基因啟動子序列及其 SNPs 結構和功能研究 ［D］。 華中科技大學， 2016。