純化前準備
1。 推薦在中性至弱鹼性條件下（pH 7-8）結合重組蛋白。磷酸鹽buffer是常用的緩衝液，Tric-Cl在一般情況下可用，但要注意它會降低結合強度。
2。 避免在buffer中包含EDTA或檸檬酸鹽等螯合劑。
3。 若重組蛋白以包涵體形式表達，在所有的buffer中新增6 M鹽酸胍或8 M尿素
4。 避免緩衝液中有高濃度的電子供體基團，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等
5。 各種緩衝液裡不能有高濃度的強還原劑，，比如DTT，防止二價Ni被還原；
6。 不能含離子型的去垢劑，比如SDS，防止Ni流失；
7。 緩衝液裡可以加入甘油，防止蛋白之間由於疏水相互作用而發生聚集沉澱，甘油濃度最高可達50%（v/v）
8。 緩衝液裡NaCl的濃度應在300mM到2M之間；
9。 可加入非離子型去垢劑，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以減少背景蛋白汙染和去除核酸汙染
注：
1。 包含尿素的樣品可直接進行SDS-PAGE分析，若樣品中包含鹽酸胍，在SDS-PAGE前則需先用含有尿素的buffer進行透析
2。 除利用咪唑洗脫蛋白，其它方法，如低pH值法等可被應用，詳見說明書
B
inding buffer 中咪唑的濃度
在洗滌時所用的Binding buffer 中咪唑濃度越大，重組蛋白純度越高。但過高的咪唑濃度將導致蛋白的洗脫。合適的咪唑濃度需要最佳化。
Buffer 的準備
所用的水及化學物質須是高純度的。Buffer 在使用前需經0。45μm濾膜過濾。所用高純度的咪唑需在280nm 處無吸光度或吸光度極低。
推薦 buffer
（
使用前用0.45 μm filter過濾）
Binding buffer：20 mM 磷酸鹽
0。5 M NaCl
20- 40 mM 咪唑 pH 7。4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變！）
Elution buffer ：20 mM 磷酸鹽
0。5 M NaCl
500 mM 咪唑 pH 7。4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變！）
1. 樣品準備
樣品需被充分溶解。過柱前經0。45 μm濾膜過濾。樣品以pH 7。4 binding buffer 溶解。勿用強酸強鹼調節pH 值，否則將可能導致沉澱。
2. 重力純化法
Ni-NTA Column
準備
1。溫和地顛倒瓶中的Ni-NTA Agarose 數次。
2。 吸取2ml的樹脂加入15ml離心管中，使樹脂在重力（5–10 minutes）或低速離心（5 minute at 500 × g），輕柔的吸出上清。
3。 加入5ml的無菌蒸餾水，溫和的顛倒柱子3min，離心 5 minute at 500 × g，輕柔的吸出上清。
4。 用bingding buffer 重複第3步。
5。 在Ni 柱中加入等體積的bingding buffer，製成50%的slurry
Ni柱子的beads浸泡在
20% ethanol中，傾除20% ethanol溶液，用蒸餾水將beats調成75%（v/v）的濃漿狀的凝膠。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，靜置。
3. 樣品與Ni 柱結合
1。 每1ml 50%的slurry中加入4ml 的樣品。1ml 50%的slurry 可結合20mg His-蛋白
2。 將混合物室溫，低速振盪孵育1h
4.
B
uffer 洗滌及洗脫
1。 離心 5 minute at 500 × g，輕柔的吸出上清。上清儲存放在4℃ for SDS-PAGE analysis。
2。 用1 ml Binding Buffer洗滌柱子，在搖床上溫和的振盪2min，然後低速離心 5 minute at 500 × g，小心吸出上清，重複該步一次。上清儲存放在4°C for SDS-PAGE analysis。
3。 用0。5 ml Elutionbuffer洗脫柱子，方法同4。重複該步三次。分管收集4次洗脫液，存放在4°C for SDS-PAGE analysis。
純化柱的再生：
如果純化同一種蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重複使用5－7次。
1。 用5倍柱體積的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸鹽，0。5 M NaCl pH 7。4的buffer
洗滌柱子，洗去螯合的鎳離子。
2。 用5倍柱體積的binding buffer洗滌柱子
3。 用5倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子
4。 用0。5倍柱體積的含0。1 M 的NiSO4的無菌水溶液裝填
5。 用5倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子
6。 用5倍柱體積的bingding buffer洗滌柱子
7。 加入20％的乙醇4-30℃長期儲存。
lysis buffer中加咪唑的目的是與雜蛋白競爭，使那些與填料親和力弱的雜蛋白不能掛柱；wash buffer中加咪唑是為了洗去大部分已掛柱的雜蛋白（也會洗去少量目的蛋白）；elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑濃度漸高，是咪唑和目的蛋白競爭性結合填料，從而把目的蛋白從柱上洗脫。
層析柱再生
1。 除鎳
① 10倍柱床體積的stripping buffer洗柱，1ml/min ② 10倍柱床體積的binding buffer洗柱，1ml/min （可省）
③ 10倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min
2。 除去柱上殘餘蛋白
① 1M NaOH充滿柱並保持2h ② 10倍柱床體積的binding buffer洗柱，1ml/min （可省）
③ 10倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min
3。 掛鎳
① 0。5倍柱床體積的0。1NiSO4洗柱，1ml/min ② 5倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min
③ 5倍柱床體積的binding buffer洗柱，1ml/min
4。 20%乙醇過柱，4℃儲存
注： stripping buffer：2 mM Na3PO4
0。5 M NaCl
50 mM Na2EDTA pH 7。4
蛋白純化
Elution buffer 洗柱
① 10倍柱床體積的binding buffer平衡 ② 樣品過濾，上樣（關閥門，15min）
③ 10倍柱床體積的binding buffer洗柱 ④Elution buffer 洗脫蛋白（一般蛋白位於前5ml）
⑤ 超濾管10000rpm，濃縮離心10min
注：
Binding buffer：20 mM Na3PO4 20×10-3×0。5×380。16=3。8g
0。5 M NaCl 0。5×0。5×58。5=14。625g
5mM 咪唑 5×10-3×0。5×68。09=0。17g
pH 7。4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變！）
Elution buffer ：20 mM Na3PO4 20×10-3×0。5×380。16=3。8g
0。5 M NaCl 0。5×0。5×58。5=14。625g
500 mM 咪唑 0。5×0。5×68。09=17g
pH 7。4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變！）
