“ 我們研發的 AQRNA-seq 可對各種 RNA 分子實現精確的定量分析，
這標誌著轉錄組學又往前前進了一大步。
”談及最近的論文成果，曲阜師範大學生命科學學院教授曹博告訴 DeepTech。
圖 | 曹博（來源：曹博）
此次成果和回國之前、他在麻省理工學院（MIT）的博後研究一脈相承。這一切要從生命體內的遺傳物質——核酸說起。
核酸可以分為兩種，脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。在大部分生命體中，RNA 是 DNA 的轉錄產物，參與遺傳資訊的複製和表達。
儘管 RNA 比 DNA 小得多，但它的種類、大小和結構卻遠比 DNA 複雜得多。動物細胞內主要的 RNA 種類包括核糖體 RNA、信使 RNA、轉運 RNA。
除了以上三種 RNA 外，真核細胞中還存在其他非編碼 RNA，包括長鏈非編碼 RNA、小干擾 RNA 和微 RNA等。
圖｜不同種類的 RNA
近年來，越來越多的研究表明，RNA 在生命活動中起著極為重要的調控作用，它們不僅調控著胚胎髮育、組織分化、器官形成等基本的生命活動，還與某些疾病（如腫瘤、神經系統疾病等）的發生和發展過程有關。
為了更好地研究細胞中 RNA 分子的功能，科學家們也在不斷地開發革命性的新技術，最早是 RNA 印跡（RNA blotting），可以定量檢測某些特定已知的 mRNA 水平。
接著是實時定量 PCR 技術（real time quantitative PCR），實現了對已知 mRNA 和 miRNA 水平的快速準確定量分析。
繼而是基因晶片技術，可在同一時間分析數萬個基因差異表達水平。最後，是現在如火如荼的 RNA 測序技術（RNA-seq），可以用來分析所有基因的表達水平，甚至是未知基因和全新的轉錄本。
目前，RNA-seq 已成為 RNA 調控領域和基因表達的重要技術基礎和通用手段。
圖｜RNA-seq 一般流程圖（來源：Nature）
然而， 美中不足的是，傳統 RNA-seq 的建庫過程對不同 RNA 分子捕獲能力差異很大，甚至有上千倍的差別。
因此 RNA-seq 的定量只能侷限於不同樣品間相同 RNA 分子的變化情況，而無法絕對定量分析同一樣品中不同 RNA 分子。
此外，RNA 分子上具有很豐富的表觀遺傳修飾或複雜高階結構，例如甲基化修飾，而這會導致測序中逆轉錄酶發生脫落現象，從而導致最終無法檢測或定量分析這類 RNA 分子。
針對此，曹博團隊聯合（MIT） Peter Dedon 團隊開發了一種新型的 RNA-seq 技術 ——Absolute Quantification RNA-seq（下稱 AQRNA-seq）。日前，這項研究已在Nature Biotechnology線上發表。
圖｜《Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq》線上發表在Nature Biotechnology上
區別於傳統 RNA-seq 的建庫策略，曹博重新設計了兩種接頭（linkers），並且增加了一步去甲基化酶（AlkB）處理過程，這使得 AQRNA-seq 最終實現了：
能對細胞內各種 RNA 分子無偏差、高靈敏度的捕捉；
各種小 RNA 的測序讀數和複製數之間呈直接線性相關，從而對 RNA 分子絕對定量分析；
克服 RNA 修飾對定量的干擾；
精確定位 RNA 分子上的修飾位點。
那麼 AQRNA-seq 是如何工作的呢？
如下圖所示，簡單的來說，AQRNA-seq 可分為七步。
圖｜ AQRNA-seq 流程圖
第一步：RNA 分子與 linker 1 的連線。
第二步：去甲基化處理（可選）。
第三步：RNA- linker 1 複合物的純化。
第四步：得到 cDNA 序列。
第五步：cDNA 序列與 linker 2 的連線。
第六步：linker 2-cDNA 複合物的純化。
第七步：測序。
為了實現精確定量，曹博針對 AQRNA-seq 開發了一套資料處理方法。藉助這種資料處理方法，可對各種小分子 RNA 進行精確定量，並可以檢測到傳統 RNA-seq 方法無法捕獲的 RNA 修飾，序列改變和結構改變。
為了考察 AQRNA-seq 定量的精確性，曹博設計了多種實驗方法。
首先，他們構建了包含 5 種不同長度（25-80 nt）RNA 分子的 RNA 文庫。將這些 RNA 分子分別以不同的摩爾比混合，然後用 AQRNA-seq 定量分析。
結果是每種 RNA 分子透過 AQRNA-seq 得到讀數（reads）與 RNA 的實際濃度呈直接線性關係，
這說明可以直接透過測序得到的 reads 推算各種 RNA 分子在細胞中的實際濃度。
另外， AQRNA-seq 測序的響應度大約為 300±50 reads/fmol。
圖｜ 5 種不同長度（25-80 nt）RNA 分子透過 AQRNA-seq 得到的 reads 與實際濃度成線性相關
接下來，為了考察 AQRNA-seq 文庫製備過程對不同序列的捕捉能力差異性，他構建了包含 963 種 miRNA 分子的文庫。這些序列來自同一個資料庫，長度在 16-28 nt 之間，兩個末端具有所有可能的二核苷酸組合。
然後將這些 miRNA 等濃度混合，接下來用 AQRNA-seq 定量分析。結果如下圖所示， AQRNA-seq 文庫製備過程對不同序列的捕捉能力差異性極小。
圖｜ AQRNA-seq 文庫製備過程對不同末端序列的 RNA 分子捕捉能力的差異性很小
此外，他還發現，約 75% 的 miRNA 測序結果與預期結果非常接近。和 6 種市場上常見的建庫方法相比，
AQRNA-seq 是定量最為準確的測序方法。
最後，為了驗證 AQRNA-seq 是否對含有複雜修飾和空間結構的 tRNA 也能做出精確的定量，他對大腸桿菌 K12 菌株進行了 tRNA 測序。
將測序得到的 tRNA 表達水平與文獻的 RNA 印跡分析法相比，發現兩種方法具有很強的一致性（R 2 = 0。81）。
圖｜在大腸桿菌 K12 菌株的 tRNA 定量分析中，AQRNA-seq 和 RNA 印跡分析法具有很強的一致性
綜上，曹博和團隊從不同方面驗證了 AQRNA-seq 可以絕對精確定量不同濃度、不同長度、不同序列、甚至含有複雜修飾和空間結構的 RNA 分子。
此外，在分析 963 種 miRNA 的測序結果時，他有這樣一個意外發現：
測序得到的 miRNA 末端序列多樣性，其實是在測序過程中引入的，而非天然存在。
自此，人類對 miRNA 群體的認知得以重新整理，也給 miRNA 的多樣性和複雜性的鑑定，提供了重要參考。
結核分枝桿菌的 tRNA 代謝圖譜
接下來，曹博對結核分枝桿菌進行了 tRNA 分子的動態定量分析。
首先，他對結核分枝桿菌進行飢餓處理，20 天后恢復營養，過程中用 AQRNA-seq 來監測細菌內 tRNA 分子的表達水平變化。
結果發現，飢餓處理會導致結核分枝桿菌各種 tRNA 分子的表達水平發生持續不斷的變化。
在論文中，他和團隊繪製了結核分枝桿菌 tRNA 分子在飢餓處理不同階段的代謝圖譜，
這是科學史上首次實現細胞內所有 tRNA 分子表達水平的絕對定量分析。
圖｜ 飢餓處理誘導了結核分枝桿菌中各種 tRNA 分子水平的變化
另據悉，AQRNA-seq 還能捕獲 tRNA 片段化和降解的動力學資料，這些是研究 tRNA 分子成熟過程，小分子 RNA 的基因表達調節功能等的重要資料。
除了對 tRNA 分子水平進行絕對定量，AQRNA-seq 還能對 tRNA 的修飾和結構作出定量分析和精準繪製。這種修飾作圖可以幫助以前未註釋或未定位的修飾。
腫瘤發生過程中 miRNA 的定量動態分析
大量研究表明，miRNA 與腫瘤的發生發展密切相關。
此前有文獻報道，在三陰性乳腺癌患者中，miR-15a-5p 和 miR-19a-3p 上調超過 1。8 倍。
另外，在 HER-2 過度表達的侵襲性乳腺癌型別以及炎症性乳腺癌中，miR-4454 也呈現上調趨勢。
並且，在乳腺癌腫瘤幹細胞中，miR-27a 出現明顯下調。用一定的手段提高 miR-27a 表達後，腫瘤呈現體積變小，生長速度減慢的趨勢。
為了研究腫瘤發生過程中 miRNA 水平的動態變化，曹博對不同惡性程度細胞的 miRNA 水平進行了 AQRNA-seq 分析。
如下圖所示，首先，他們用 SV40 大 T 抗原和端粒酶催化亞單位，使人乳腺上皮細胞 HMEC 永生化，得到 “正常狀態” 的 HMEC1 細胞。
圖｜基於人乳腺上皮細胞（HMEC）的不同處理，模擬乳腺癌的發生過程
然後，在 HMEC1 細胞基礎上，用他莫昔芬處理誘導 H-Ras 過表達，得到惡性程度較低的 HMEC2 細胞。
接著，在 HMEC2 細胞基礎上，用短髮夾 RNA 降低 P53 的表達，得到惡性程度較高的 HMEC3 細胞。
測序結果表明：和 HMEC1 細胞相比，HMEC3 細胞中上調最明顯的三種 miRNA 為 miR-15a-5p、miR-19a-3p、miR-4454；
下調最明顯的四種 miRNA 為 miR-24-3p、miR-4488、miR-21-5p、miR-27a-3p，和上述有關文獻報道是一致的。
這說明 AQRNA-seq 有望在腫瘤研究中大放異彩，為腫瘤新靶點的發現作出貢獻。
圖｜HMEC1、HMEC2、HMEC3 細胞中差異最明顯的 14 種 miRNA
儘管在論文中，曹博僅對 tRNA 和 miRNA 的定量分析展開了例項研究，但是AQRNA-seq 已經透過國際 PCT 申請，並分別在歐美和中國獲得專利授權。本次成果的商業化試劑盒也正在開發中，未來有望推動 RNA 測序進入絕對定量新時期。
圖｜曹博和學生（來源：曹博）
此外，AQRNA-seq 新版本（version 2。0）也已經研發完畢。在新版本中，曹博優化了多個關鍵步驟，實現了 PCR dimer-free 的建庫技術。
新版本不僅能和 small RNA-seq 技術通用，還攻克了必須透過膠回收除去 PCR 引物二聚體的繁瑣步驟，RNA 建庫全自動化的關鍵限制因素得以突破，AQRNA-seq 也有望成為 RNA 測序的新型通用平臺。
-End-
責編：多加
