1。 實驗目的
使用抗原免疫後羊駝PBMC構建的噬菌體文庫篩選能特異性結合抗原的奈米抗體序列。
2。 實驗設計
透過將抗原包被至免疫管，使用構建的噬菌體展示文庫對特異性結合的噬菌體進行多輪淘洗篩選，當淘洗後的噬菌體達到合適富集程度後進行ELISA驗證以排除非特異性序列，最後對ELISA驗證陽性克隆進行測序獲得相應奈米抗體的序列。
3。 實驗方法與步驟
3。1第一輪篩選
3。1。1從-80℃冰箱中取出篩選抗原，冰上放置解凍；
3。1。2將XX抗原包被免疫管（50 g/管，包被液為CBS，pH9。6，2ml /管），4°C緩慢旋轉過夜，同時平行包被50 g 5% Non-fat milk脫脂奶粉作對照；
3。1。3將過夜包被的免疫管中的液體棄掉，加入2ml PBS緩衝液室溫清洗免疫管3次，每次旋轉5min；
3。1。4加入2ml封閉液（3% PBSTB）溶液，室溫旋轉封閉2h；
3。1。5將封閉後的免疫管中液體丟棄，並加入1ml PBS緩衝液室溫清洗免疫管3次，每次旋轉5min；
3。1。6棄掉免疫管中的清洗液，加入2ml PBS緩衝液，按照下列公式計算並加入製備的噬菌體文庫作為第一輪篩選輸入噬菌體文庫，室溫旋轉孵育1h：
3。1。7將免疫管內液體棄掉，加入2ml PBST（1×PBS加0。1% Tween20，下同）緩衝液室溫清洗免疫管20次，每次旋轉5min；
3。1。8將免疫管內液體棄掉，儘量去除殘餘液體，加入1ml 0。25mg/ml Trypsin溶液，室溫旋轉洗脫30min；
3。1。9加入10μl 10%AEBSF終止洗脫，將免疫管中的溶液轉移至新的1。5ml離心管中，即為第一輪篩選噬菌體洗脫液。
3。2第一輪噬菌體洗脫液效價檢測
3。2。1將-80℃冰箱儲存的SS320菌株在2×YT固體培養基（Tet抗性）進行單菌落劃線，37℃過夜培養（4℃儲存一週），從單菌落板上挑取一個單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養基，37℃過夜培養；
3。2。2取過夜培養菌液250μl轉接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養基中，37℃，250rpm培養約45min-60min後至OD600為0。5-0。55；
3。2。3取第一輪噬菌體洗脫液10μl，在1。5ml離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋12個梯度，即將噬菌體文庫取10μl稀釋至100μl，再從中取10μl稀釋至100μl，依次類推，共稀釋12個梯度至10-12，振盪混勻；
3。2。4在每個稀釋離心管中加入90μl的SS320菌液，混勻後37℃孵育30min；
3。2。5從每個稀釋離心管中取5μl滴加到2×YT固體培養基（Amp）中，37℃倒置過夜培養；
3。2。6統計板上可以明顯區分單菌落的稀釋度的單菌落數量，並按照下面公式計算每毫升噬菌體溶液中噬菌粒的數量，即噬菌體文庫效價。
3。3第一輪噬菌體洗脫液的擴增
3。3。1預先將-80℃冰箱儲存的SS320菌株在2×YT固體培養基（Tet抗性）進行單菌落劃線，37℃過夜培養（4℃儲存一週），從單菌落板上挑取一個單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養基，37℃過夜培養；
3。3。2取過夜培養菌液250μl轉接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養基中，37℃，250rpm培養約45min-60min後至OD600值為0。5-0。55；
3。3。3加入500μl第一輪篩選後得到的噬菌體洗脫液至OD600為0。5-0。55的菌液中（剩餘的洗脫液4℃儲存）；
3。3。3 37℃，220rpm繼續培養30 min；
3。3。5將全部菌液均勻塗布到含有100μg/ml Amp和2%葡萄糖的2%瓊脂糖的245mm方形培養基平板中，37℃過夜培養；
3。3。6取過夜培養的方形板，在培養板表面加入6ml 2×YT液體培養基（含10μg/ml Tet），用塗布棒輕輕將方形板菌落刮下並將菌液收集至15ml離心管中，即為擴增後的細菌子文庫，同時使用分光光度計測量菌液OD600值，即為洗脫液細菌文庫OD600值，加入終濃度為20%的甘油，即為第一輪細菌文庫。
3。3。7將洗脫液細菌文庫根據下面公式計算出相應菌液量，轉接至100ml 2×YT液體培養基中（含10μg/ml Tet和100μg/ml Amp），以使初始OD600為0。1：
3。3。8 37℃，250rpm培養直至菌液OD600達到0。5-0。55；
3。3。9加入輔助噬菌體M13K07以使細菌個數：噬菌體數=1：20；
3。3。10 37℃，220rpm繼續培養30 min；
3。2。11分別加入終濃度為50μg/mlKana和終濃度為0。2μM IPTG，30℃，250rpm過夜培養。
3。4第一輪噬菌體純化
3。4。1將過夜培養的菌液轉移至新的50ml離心管中4000 rpm，4 ℃離心10min；
3。4。2將離心後的上清液轉移至新的50ml離心管中，加入1/4體積的4℃預冷的20％PEG/2。5M NaCl，充分混勻後冰上放置30min；
3。4。3 4000 rpm，4 ℃離心20 min，棄上清，並在紙上倒置2min；
3。4。4加入1ml PBS重懸沉澱，將重懸液移至新的1。5ml離心管，12000rpm，4 ℃離心20min；
3。4。5將離心後的上清轉移至新的1。5ml離心管，加入1/4體積預冷的20％PEG/2。5M NaCl溶液，混勻後冰上放置10min；
3。4。6 12000rpm，4 ℃離心10min，棄上清，加入1ml PBS重懸沉澱；
3。4。7 12000rpm，4 ℃離心2min，將上清轉移到新的1。5ml離心管中，即為第一輪篩選噬菌體子文庫，100μl /管分裝，長期-80℃儲存，短期（1-2周）可於4℃放置儲存
3。4。8第一輪篩選噬菌體子文庫效價檢測，方法同3。2。
3。5第二輪篩選
篩選方法同3。1，輸入噬菌體為第一輪篩選得到噬菌體子文庫，作為第二輪篩選輸入噬菌體文庫，得到第二輪篩選噬菌體洗脫液。
3。6第二輪噬菌體洗脫液效價檢測
方法同3。2。
3。7第二輪洗脫液的擴增、純化
方法同3。3-3。4，得到第二輪篩選噬菌體子文庫。
3。8第二輪篩選噬菌體子文庫效價檢測，
方法同3。2。
3。9單克隆ELISA檢測
3。9。1預先將-80℃冰箱儲存的SS320菌株在2×YT固體培養基（Tet抗性）進行單菌落劃線，37℃過夜培養（4℃儲存一週），從單菌落板上挑取一個單菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培養基，37℃過夜培養；
3。9。2取過夜培養菌液250μl轉接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液體培養基中，37℃，250rpm培養約45min-60min後至OD600值為0。5-0。55；
3。9。3取第二輪篩選後噬菌體洗脫液10μl，在1。5ml離心管中10倍梯度稀釋，共稀釋12個梯度，即將噬菌體文庫取10μl稀釋至100μl，再從中取10μl稀釋至100μl，依次類推，共稀釋12個梯度至10-12，振盪混勻；
3。9。4每個稀釋離心管中加入90μl OD600值為0。5-0。55的菌液，混合均勻；
3。9。5 37℃，220rpm繼續培養30 min；
3。9。6將菌液均勻塗布到含有100μg/ml Amp的固體培養基平板，37℃過夜培養；
3。9。7從過夜培養後的培養基平板中隨機挑取單克隆菌落於無菌96孔細胞培養板中，每孔加入200 l 2×YT培養基（含有100 g/ml Amp和10 g/ml Tet），37℃過夜靜置培養；
3。9。8取過夜培養的菌液2 l轉接至每孔200 l 2×YT液體培養基（含有100 g/ml Amp和10 g/ml Tet）的新96孔細胞培養板中，37℃靜置培養3h，將轉接前過夜培養的菌液4℃儲存；
3。9。9按照下面公式計算並每孔加入輔助噬菌體M13K07以使細菌個數：噬菌體數=1：20：
3。9。1037℃孵育30 min，加入終濃度為50 g/ml的Kana和0。2 M的IPTG，30℃靜置過夜培養；
3。9。11將過夜培養後的96孔培養板4℃，4000rpm離心10min，4℃儲存備用；
3。9。12將抗原包被酶標板（1ng/μl，包被液為CBS，pH9。6，100μl /孔），同時平行包被BSA作對照，4°C包被過夜；
3。9。13將過夜包被的酶標板內液體棄掉，每孔加入200 l PBS緩衝液，室溫清洗酶標板3次，每次10min；
3。9。14每孔加入200μl封閉液（3% BSA）封閉酶標板，室溫封閉1h；
6。9。15棄封閉液，每孔加入200 L PBST（1×PBS加0。1% Tween20，下同）緩衝液，室溫清洗酶標板3次，每次10min；
3。9。16每孔加入120μl 3% BSA後再加入80 l步驟3。6。11中離心後的上清液，室溫孵育2h；
3。9。17棄掉酶標板內液體，每孔加入200 lPBST緩衝液洗滌3次，每次10min；
3。9。18每孔加入M13 Bacteriophage Antibody（HRP），Mouse Mab，稀釋於封閉液中，100μl/孔，室溫孵育1h；
3。9。19棄掉ELISA板內液體，每孔加入200 lPBST緩衝液洗滌3次，每次10min；
3。9。20每孔加入100 l TMB單組份顯色液，避光顯色2-3min，每孔加入100 l 1M HCl終止，用酶標儀讀取OD450值，記錄並儲存。
3。10陽性克隆ELISA二次驗證
為了排除假陽性結果，將初步認定為陽性克隆進行ELISA二次驗證，方法同3。9。8-3。9。20。
3。11陽性克隆測序
根據ELISA檢測資料和二次驗證資料選定陽性單克隆
從單克隆ELISA檢測（3。6。3）板中取陽性克隆菌液5 l接種至2ml 2×YT培養基（含有100 g/ml Amp和10 g/ml Tet），37℃，250 rpm培養直至OD600至0。8-1。0（約6-8h），取1ml菌液測序，其餘菌液4℃儲存。
3。12序列分析
經測序的序列使用軟體進行序列比對分析，並使用軟體將抗體序列翻譯成氨基酸。
4。 實驗結果
4。1二輪篩選結果
富集程度為篩選效價除於輸入效價，數值越高表明抗體在輸入庫中富集程度越高；
相差倍數為篩選效價除於對照效價，數值越高表明陽性抗體在篩選庫中含量越高。
當相差倍數大於100-1000倍時認為篩選進行ELISA單克隆檢測。
4。2單克隆ELISA檢測結果
免疫管篩選後，隨機挑選單克隆進行ELISA檢測，陽性克隆為目的抗原的OD450值大於對照OD450值3倍且讀值大於0。5。
4。3陽性克隆ELISA二次驗證結果
陽性克隆為目的抗原的OD450值大於對照OD450值3倍且讀值大於0。5。
4。4序列多樣性結果
將ELISA二次驗證的陽性克隆進行測序，序列使用GENtle軟體翻譯得到抗體序列，透過序列比對分析，得到不同的抗體序列。
4。5氨基酸序列
將抗體序列使用GENtle軟體翻譯成氨基酸後，得到抗體序列。