光遺傳的技術是用光的方式精確控制一群神經元的啟用與抑制。簡單來說就是以轉基因的方式讓特定神經元表達某些特殊的光敏感的通道蛋白（channel）或者光敏感的泵（pump），然後我們再用特定波長的LED或者鐳射光源對特定腦區進行照射，就可以達到調控這些腦區內神經元活動的目的。
光遺傳也分為用光的方式啟用一些神經元，或者抑制一些神經元。在稍微複雜一點的決策、規劃（decision-making， planning）等等任務中，大腦的神經元是在一個特定的pattern上編碼的，所以我們靠啟用的方式很難模擬出特定的patterm，因此更常用的是直接在特定的時間（比如說動物做任務做到某個階段的時候）抑制這個腦區或者某一群神經元，直接觀察這個短暫的“失活”所帶來的影響，從而觀察某個腦區在特定的決策、規劃（decision-making， planning）等等任務中所起到的作用。
那麼，我們到底怎麼實現對一個腦區的抑制呢？到底哪種方法更好呢？這就是這次我想簡單的總結一下的內容！
基本思路：直接抑制啟用性神經元，or啟用抑制性神經元
在大腦皮層中既有興奮性的神經元，也有抑制性的神經元。興奮性的神經元一般是一些比較主要的負責向外投射資訊的神經元（椎體細胞，Pyramidal neuron，基本都是穀氨酸遞質的神經元）。而抑制性的神經元一般都是以GABA為遞質的，又可以分為主要三類有特別markers的神經元（Rudy et al。， 2011）： 1）parvalbumin 神經元 （PV neurons）；2）somatostatin 神經元 （SST+ neurons）；3） 5HT3a 。而PV和SST神經元是主要抑制興奮性的椎體神經元的（Pyr），5HT3a主要抑制SST和PV，從而會間接的對椎體神經元起到去抑制的作用。
（Katzam et al。， 2018）
從最簡單的思路來講，抑制一個腦區那就是：直接抑制主要的啟用性的細胞，所以我們可以透過直接抑制這一群主要的椎體神經元，或者抑制穀氨酸遞質的神經元來抑制這個區域向外的興奮性投射。
稍微間接一些，我們可以去啟用抑制性的神經元，從而透過啟用抑制性神經元去抑制這個腦區興奮性的發放以及對外輸出，那我們就可以透過啟用PV/SST神經元為主的GABA神經元來對腦區進行抑制。
在光遺傳的實際操作中，我們核心的目標就是讓這些我們需要的神經元（比如啟用性神經元或者抑制性的神經元）表達出來一些特定的光敏感的蛋白（比如啟用或者抑制），後續就可以透過鐳射直接去控制這些神經元的啟用以及抑制了。
可以有那些光敏感蛋白可以用？
光遺傳最經典的蛋白是channelrhodopsins （ChR2），是一種光敏感的陽離子通道，只要收到光的照射（最敏感的是大概470nm的藍光），立馬會開啟然後允許Na+ K+等陽離子跨膜流動，從而讓神經元去極化（即啟用）。
ChR2還有一些變種可以用。比如陰離子通道模式的channelrhodopsins（GtACR1， Guillardia theta anion channel rhodopsin 1）。最敏感的波長也大概是470nm左右，會選擇性地讓各種陰離子透過，比如Cl-，從而超極化膜電位抑制到神經元。
另外比較經典的除了通道還有一些泵蛋白。最主要的比如是Halorhodopsins （NpHR）。是一種跨膜的氯離子泵，可以吧氯離子搞進細胞然後超極化膜電位抑制到神經元。後續人們對NpHR進行了一些改良，比如提高他們在細胞膜上的密度，會有更好的特性等等，現在大家更常用的是eNpHR3。0。但是對於泵來說效率會比上面提到的光敏感通道低很多，因為比如說泵一個光子只能泵進來一個離子，但是通道的話一旦開啟可以流過很多很多離子，所以一般用泵的話鐳射強度要大不少。ChR2一般是1mW左右打進去，但是NpHR基本都是要10mW才能達到同樣的效果。NpHR一般是用黃光（589nm）啟用效率最大化。但是綠光會便宜很多也有很多人用，530nm左右也可以，但是效率會低一些。
光敏感的質子泵也可以用來抑制神經元：Archaerhodopsins（Arch）， 它也有改進版比如eArch3。0 。它在收到光照以後會吧H+泵出細胞，從而超極化膜電位達到抑制神經元的效果。大概需要566nm的黃綠光。但是他會改變細胞的PH從而產生一些更多的奇怪的影響。
我們知道波長更長的光會有更長的穿透性（比如說為什麼朝霞和晚霞是紅色的）。所以用紅光（590nm）會有更好的穿透性，被組織吸收更少，產生更大的作用。上面提到的這些蛋白很多都有紅光啟用的變種。比如說ChR2的紅光變種：ReaChR。Nphr紅光變種：Jaws。
但是光遺傳還有另一個問題就是照射會產生熱效應，會慢慢的殺掉或者鐳射漂白周圍組織，所以光劑量打進去腦子裡很多以後就會不能用了。波長越長的光熱效應越大。所以如果用藍光，低劑量的照射，可以用的時間會更久。
怎麼讓特定的神經元具有這些光敏感蛋白？
我們要抑制這個腦區的話，必須要讓興奮性的細胞被直接抑制，或者去啟用抑制性的細胞。那麼就需要特定的讓這些型別的細胞能表達出來光敏感的蛋白。
這個方法主要是要用到不同的啟動子：特定的神經元雖然基因是一樣的，但是各種基因的表達是不一樣的，在不同的選擇性表達下，不同啟動子後面的基因會有不一樣的結果。比如說所有的GABA神經元都有VGAT的啟動子，而椎體細胞都會用到CamKII的啟動子，還有絕大部分也有VGluT2+啟動子等等。我們可以吧目標的光敏感蛋白的基因序列，再加上熒光蛋白的基因序列放到這個特定的啟動子後面構成一串基因序列，透過轉基因老鼠，或者打病毒的方式獲得這些基因在特定神經元的表達。
直接獲得轉基因老鼠
最直接的辦法是購買轉基因的老鼠，直接就是有這種光敏感蛋白的老鼠。比如說我們想要GABA神經元表達ChR2的老鼠，就可以直接購買VGAT-ChR2-EYFP老鼠 （JAX 014548）。這種基本就是拿來老鼠以後直接放光纖就可以用了。不需要再做額外的操作。
打病毒
透過反轉錄的AAV病毒，比如說存在某一個啟動子後面帶一個特定蛋白的序列的病毒，病毒就回吧這串序列轉入感染的神經元，然後神經元就會表達出來這種特定的蛋白。比如我們可以使用這種病毒pAAV9-CamKII-eNpHR3。0-EYFP （AAV病毒搭載CamKII啟動子以及eNpHR3。0和EYFP的基因序列，這會讓eNpHR3。0在感染到的椎體神經元內表達，並且會帶一個EYFP熒光蛋白用於後續實驗結束後現實一下病毒感染的範圍）。
cre操作
很多時候我們並不能直接獲得直接帶光敏感通道的老鼠或者直接在我們需要的啟動子後面帶我們需要基因的病毒。這個時候我們就需要用到cre-loxp系統的來構建一個條件性的表達。簡單來說就是先讓部分特定的細胞表達cre，同時讓所有細胞都具有一個沉默的不表達的光敏感蛋白的基因（用loxp包住終止子，或者用loxp構建一個反義序列DIO），特定細胞的所表達出的cre就會啟動光敏感蛋白的表達。這又有四種方法。1）用cre轉基因老鼠，結合有特定的loxp的+光敏感蛋白的轉基因老鼠交配獲得；2）cre轉基因老鼠+打病毒轉入loxp光敏感蛋白；3）打病毒轉入特定的啟動子帶cre+loxp光敏感蛋白轉基因老鼠；4）同時打帶特異性啟動子-cre的病毒+loxp光敏感蛋白的病毒。下面我逐個舉個例子。
1）兩種轉基因老鼠交配：還是比如說我們想要GABA神經元表達ChR2的老鼠。我們可以先找一隻在GABA神經元能表達cre的老鼠（cre以VGAT啟動子表達），再找一隻表達了帶loxp-ChR2基因的老鼠交配，他們的下一代老鼠的GABA神經元內的cre就可以去啟用光敏感蛋白的表達。比如說我們可以找這種VGAT-IRES-Cre（JAX 016962）老鼠（這種老鼠在VGAT啟動子後表達cre，VGAT是GABA神經元都會啟用的啟動子），再拿一個Ai32（JAX 012569）老鼠， 這種老鼠帶這樣一個基因：Rosa-CAG-LSL-ChR2（H134R）-EYFP-WPRE。簡單來說就是CAG啟動子後面有loxp夾了個終止子，如果Cre存在的話cre會剪掉這個終止子從而表達後面的ChR2（H134R）-EYFP。這樣在他們的子代裡，GABA神經元的cre就會讓ChR2得到表達，從而可以透過鐳射啟用抑制性的GABA神經元。
2）cre轉基因鼠+病毒表達光敏感蛋白：比如說拿一隻VGAT-IRES-Cre（JAX 016962）老鼠，打這種病毒AAV2/9-EF1a-DIO-hChR2（H134R）-mCherry。那麼被感染的神經元就會表達一個反轉的ChR2的序列（透過DIO），然後Cre會吧這個序列翻正從而得到正常的表達。但是這種老鼠只有GABA神經元裡有Cre，所以就只有GABA神經元的cre就會讓ChR2得到表達。
3）光敏感蛋白的轉基因鼠+cre病毒：比如說拿一隻上面提到的Ai32（JAX 012569，Rosa-CAG-LSL-ChR2（H134R）-EYFP-WPRE）老鼠，打這種病毒：AAV2/9-VGAT1-CRE-WPRE-pA。那麼被感染的GABA神經元就會表達cre，從而啟用老鼠體內不表達的ChR2。
4）打兩種病毒：也可以直接打上面提到的AAV2/9-EF1a-DIO-hChR2（H134R）-mCherry病毒+AAV2/9-VGAT1-CRE-WPRE-pA病毒，混在一起。這樣被兩種病毒同時感染的GABA神經元就會表達ChR2了。
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文章來源：
https：//zhuanlan。zhihu。com/p/362349621
文章作者：知乎-李競捷
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