腦出血（ICH），又稱腦溢血，是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，佔全部腦卒中的20%～30%，急性期病死率為30%～40%。發生的原因主要與腦血管的病變有關，與高血脂、糖尿病、高血壓、血管的老化、吸菸等密切相關。腦出血的發病率與致死率均非常高，但依然未有成熟的療法［1］。
圖片來源：doktorsalihaydin。com
目前，腦出血的治療方法主要針對腦出血後的繼發性腦損傷［2］。繼發性腦損傷發生於腦出血後的一段時間，由裂解血中多種因子引起，其中包含血紅素以及氧化型亞鐵血紅素等等［3］。
繼發性腦損傷（圖片來源： neurologyadvisor。com）
近期研究表明，腦出血造成的繼發性腦損傷由鐵死亡引起。鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴性的，區別於細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型的細胞程式性死亡方式［4］。除腦出血之外，鐵死亡還參與腫瘤細胞氧化應激、植物熱應激、缺血再灌注損傷、創傷性腦損傷以及帕金森疾病。但是，鐵死亡刺激引起細胞產生適應性轉錄的分子機制，及抑制鐵死亡的方法，尚未可知。
Erastin或柳氮磺吡啶等小分子誘導腫瘤細胞鐵死亡
圖片來源：Trends in Cell Biology ［5］
2019年5月2日，《Cell》雜誌刊登了美國威爾康奈爾醫學院Rajiv R。 Ratan研究組的最新重要工作［6］，他們發現硒抑制神經元鐵死亡的分子機制，並開發一種含硒代半胱氨酸的多肽，這種多肽可以有效緩解腦出血及腦缺血卒中小鼠的病症。本篇文章首次揭示硒保護神經元的分子機制，並開發了治療性多肽，極大提高了人們在腦卒中領域的認知。
Rajiv R。 Ratan， M。D。， Ph。D。
結果
01
腦出血等鐵死亡刺激上調保護性硒蛋白的轉錄水平
首先，為探究鐵死亡刺激對多基因轉錄水平的調節作用，作者使用培養的原代皮層神經元，將HCA或Hemin作用於神經元6h以誘導鐵死亡，並透過qPCR手段檢測各種抗氧化酶的轉錄水平。他們發現，兩種鐵死亡刺激均引起GPX4、SELP、TXNRD1和GPX3四種硒蛋白轉錄水平顯著上調，其中GPX4的翻譯水平亦顯著上調（圖1A， B， E）。他們又引入在體實驗，在小鼠單側紋狀體中注射膠原酶以誘導腦出血，發現注射一側紋狀體中GPX4、SELP、TXNRD1和GPX3的轉錄水平在注射膠原酶6h後顯著上調（圖1C-D）。
為證實GPX4的保護性，作者引入不穩定形式的GPX4——ddGPX4，只有在TMP的作用下，ddGPX4才能穩定表達。他們在神經元中表達ddGPX4，以HCA或Hemin作為鐵死亡刺激，發現加入TMP後，神經元存活率顯著上升（圖1F-G）。作者還引入在體實驗，在小鼠的紋狀體中注射
AAV-esyn-GPX4
以實現GPX4的過表達，14天后在同側紋狀體注射膠原酶以誘導腦出血，再過14天檢查神經元死亡情況以及動物的行為學表徵。他們發現，紋狀體神經元過表達GPX4後，神經元死亡率大幅減少，小鼠的感覺忽略與空間忽略症狀得到了有效緩解（圖1H-J）。
以上結果表明，HCA、Hemin以及腦出血這三種鐵死亡刺激上調多種硒蛋白的轉錄水平，其中GPX4具有神經保護性。
圖1 鐵死亡刺激上調保護性硒蛋白的轉錄水平
02
硒處理促進GPX4等保護性硒蛋白的轉錄反應
研究表明，硒是一種必需的微量營養素，是合成氨基酸硒代半胱氨酸的必需物質［7］。含硒代半胱氨酸的硒蛋白對氧化應激的抗性更強［8］。在培養液中，亞硒酸鈉常用作細胞的硒來源［7］。於是，作者以此研究硒是否可以提供神經保護性。
他們發現，亞硒酸鈉處理後，HCA或Hemin誘導原代皮層神經元的鐵死亡數量顯著減少，此現象可維持幾個小時之久（圖2A-C）。他們還發現，亞硒酸鈉處理提高神經元內GPX4等多種硒蛋白的轉錄水平，而轉錄抑制劑Act D可阻斷硒蛋白轉錄水平的升高以及神經元的保護效應（圖2D-F）。以上結果表明，硒可提高保護性硒蛋白的轉錄水平以阻止神經元的鐵死亡。
接著，為進一步探究GPX4在此過程中的功能，作者透過siRNA沉默GPX4。他們發現，GPX4表達下調後，亞硒酸鈉處理不再減少神經元的鐵死亡（圖2G-H），表明GPX4在亞硒酸鈉透過上調硒蛋白轉錄水平以保護神經元過程中具有必要性。
圖2 硒處理促進硒蛋白轉錄水平以保護神經元
03
硒處理抑制腫瘤細胞鐵死亡以及內質網誘導的神經元死亡
前文提到，Erastin可誘導腫瘤細胞鐵死亡［5］，為探究硒是否同樣參與此過程，作者在小鼠原代層神經元和人類纖維肉瘤細胞培養液中加入亞硒酸鈉，發現Erastin誘導神經元以及纖維肉瘤細胞鐵死亡數量顯著減少，纖維肉瘤細胞中多種硒蛋白轉錄水平顯著增加（圖3A-B）。
然後，作者探究硒保護神經元的分子機制。他們使用RNA sequencing手段，探究亞硒酸鈉作用下，神經元內差異性表達的基因。他們發現，加入硒後神經元含外顯子1a和含外顯子1b的GPX4轉錄水平均顯著提高，其中含外顯子1a 的GPX4位於線粒體，含外顯子1b的GPX4位於細胞核（圖3C-D）。在加入硒的條件下，線粒體和細胞核中GPX4表達水平均顯著升高（圖3E-F），表明細胞核和線粒體中的GPX4均參與硒對神經元的保護作用。
為系統化RNA sequencing分析結果，作者引入加權基因共表達網路分析（WGCNA）方法［9］以探究與線粒體GPX4共調節的基因，發現多種神經保護性基因表達水平上調（圖3G-H）。此外，硒處理也參與內質網應激誘導的神經元死亡（圖3I）。
圖3 硒處理抑制腫瘤細胞鐵死亡以及內質網誘導的神經元死亡
04
硒處理透過轉錄因子TFAP2c和Sp1上調GPX4表達
接下來，作者研究GPX4的啟動子和上游調節域以探索硒調控GPX4等硒蛋白轉錄水平的分子機制。他們透過靶向敲除方法，發現GPX4基因-1，189到-1，467 bp亞結構域對硒誘導啟動子活性至關重要，此結構域中5個基序與轉錄因子AP-2（TFAP-2）家族的結合位點相似，其中3個基序突變即可阻斷硒的作用（圖4A-C）。
研究表明，TFAP-2家族在人類和小鼠中高度保守，共有5種亞型（TFAP2a-e）［10］。其中，只有TFAP2c存在於小鼠原代神經元。作者引入染色質免疫共沉澱方法（ChIP），發現硒處理顯著增強TFAP2c與GPX4基因-1，189到-1，467 bp亞結構域的結合作用，此結合作用在硒處理4小時後最強（圖4D， F）。前文提到，硒處理至少可作用6小時，表明其它轉錄因子亦參與此過程。
在其它基因中，TFAP2c的結合位點與Sp1有共標［11］，表明Sp1可能參與硒處理4小時以後的轉錄調控作用。ChIP結果顯示，硒處理顯著增強Sp1與GPX4基因-1，189到-1，467 bp亞結構域的結合作用，此結合作用在硒處理6小時後最強（圖4E-F），證實了上述假設。作者還引入缺乏TFAP2c結合域的GPX4基因，進一步證實TFAP2c和Sp1在硒處理誘導神經保護性中的作用（圖4G-H）。此外，過表達TFAP2c或Sp1促進原代皮層神經元中鐵死亡相關硒蛋白的表達（圖4I-K）。
綜上所述，硒處理透過轉錄因子TFAP2c和Sp1上調GPX4等硒蛋白表達，進而產生神經元保護性。
圖4 硒處理透過轉錄因子TFAP2c和Sp1上調GPX4表達
05
腦室內注射硒上調Sp1和GPX4表達並促進功能恢復
在探究硒處理在離體神經元中的分子機制之後，作者就其在體功能展開進一步研究。他們在小鼠紋狀體中注射膠原酶誘導腦出血模型，一定時間後在小鼠腦室中注射亞硒酸鈉，並透過qPCR探究膠原酶注射處各基因轉錄水平（圖5A）。他們發現，硒處理後GPX4等硒蛋白轉錄水平顯著上調（圖5B-C）。他們還發現，在紋狀體注射膠原酶2小時後在腦室中注射亞硒酸鈉，小鼠神經元死亡率顯著降低，血腫面積顯著減少，感覺忽略與空間忽略症狀亦得到了顯著緩解（圖5D-H）。免疫熒光結果顯示，硒處理後7天，小鼠紋狀體中Sp1和GPX4的表達水平均顯著增加（圖5I-J），表明Sp1和GPX4在小鼠紋狀體神經元中已參與硒處理的保護性作用。
圖5 腦室內注射硒上調Sp1和GPX4表達並促進功能恢復
06
Tat SelPep上調Sp1和GPX4表達並促進功能恢復
儘管上文結果顯示，腦室內注射硒可緩解腦出血帶來的繼發性鐵死亡。但是，臨床實驗在人體實施腦室內注射會造成腦損傷，且很可能引起感染。更重要的一點是，硒處理的作用濃度非常難把握，只在0。5-1 μM療效較好（圖6A）。
為解決此問題，作者引入一種多肽——Tat SelPep，這種多肽包含硒代半胱氨酸，且可透過血腦屏障［12］。在原代皮層神經元培養液中加入Tat SelPep後，Hemin誘導的鐵死亡現象顯著減少，且作用濃度比較廣——大於1μM即可（圖6B-D）。qPCR結果顯示，Tat SelPep可上調GPX4等多種硒蛋白的轉錄水平，且Sp1參與此過程（圖6E）。
接著，是在體驗證實驗。作者在小鼠紋狀體中注射
AAV-esyn-mSp1
以在紋狀體神經元中過表達Sp1突變體（mSp1）以抑制Sp1活性，13天后在相同位置注射膠原酶以誘導腦出血模型，2小時或6小時在小鼠腹腔中注射Tat SelPep（圖6F，J）。他們發現，Tat SelPep作用可緩解小鼠感覺忽略與空間忽略症狀，而抑制Sp1活性後這些症狀不再緩解（圖6G-H，J-K）。
以上結果表明，和硒相比，Tat SelPep具有更好的療效以及更廣的應用空間。
圖6 Tat SelPep上調Sp1和GPX4表達並促進功能恢復
07
Tat SelPep減少缺血性卒中模型鼠的腦梗死體積
最後，作者探究Tat SelPep在缺血性卒中模型鼠中是否具有相同功能。他們結紮小鼠大腦中動脈45分鐘以誘導缺血性卒中模型，2小時後腹腔注射Tat SelPep（圖7A）。他們發現注射Tat SelPep後，小鼠腦梗死體積顯著減少（圖7B-C），表明Tat SelPep在缺血性卒中模型中同樣具有神經保護性。
圖7 Tat SelPep減少缺血性卒中模型鼠的腦梗死體積
總結
腦出血的發病率與致死率均非常高，但療法並不成熟。研究表明，腦出血會引起鐵死亡等繼發性腦損傷現象。而神經元對於各類鐵死亡刺激如何從轉錄水平產生應對，機制未明。本文結合疾病模型構建、病毒注射、基因過表達、病理檢測、行為學等方法，發現腦出血等鐵死亡刺激會上調GPX4等硒蛋白的轉錄水平。而硒處理可透過轉錄因子TFAP2c和Sp1上調GPX4等硒蛋白表達，從而保護神經元免於鐵死亡，進而恢復機體的感覺與功能。此外，他們還發現Tat SelPep具有更好的療效以及更廣的應用空間（圖8）。這項研究闡釋了鐵死亡刺激誘導細胞適應性轉錄的分子機制，並開發了治療性多肽，為臨床醫學領域治療腦出血及相關疾病提供了有力支援！
圖8 腦出血模型中Tat SelPep保護神經元的分子機制
OBiO
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