撰文：孫彥洵（華龕生物）
首發：幹細胞者說
● ● ●
截止至2021年4月，國內19項幹細胞藥物臨床試驗申請（IND）獲國家藥品評審中心（CDE）受理，其中14項獲得默許進入臨床試驗資格。幹細胞產業化所面臨著巨大的挑戰，其中
關鍵的瓶頸問題是幹細胞的高質量和規模化生產
。
無論是以多層“細胞工廠”為代表的平皿製造工藝，還是生物反應器製造工藝，均有各自的侷限性。規模化細胞製造工藝，不能只是簡單考慮細胞擴增數量，更應該關注擴增後幹細胞質量能否保持均一性。
本文將針對對“幹細胞3D微載體規模化生產工藝”，進行探討。
1
不同規模化
制
備工藝和微載體的選擇
平皿製備工藝可滿足於中小規模的細胞生產需求，但存在人工成本高、生產空間需求大、細胞產品批次生產數量有限、批次間質量不穩定等問題，嚴重製約著幹細胞產業化的發展。
生物反應器製備工藝，可作為細胞體外培養的平皿製備工藝替代品。主要有兩類：以中空纖維生物反應器為代表的灌注式生物反應器和基於微載體的懸浮攪拌式生物反應器。
中空纖維生物反應器可用於貼壁細胞、懸浮細胞、細胞分泌物（外泌體等）的生產製備，一次執行可生產4-6×10*8 數量的間充質幹細胞（MSCs）；但在貼壁細胞培養過程中，無法實時監測細胞增殖狀態和質量情況，且收穫過程面臨著胰酶消化時間長，細胞的收穫效率及質量都難以保障。
在攪拌懸浮式生物反應器中，幹細胞通常附著在懸浮於攪拌容器中的微載體上。作為幹細胞粘附培養介質，
選擇合適的微載體是幹細胞培養擴增過程中保證細胞數量和質量的關鍵變數。
微載體不僅要滿足不同型別幹細胞的粘附和增殖要求，還要考慮如何去除微載體，保證細胞治療產品的安全性情況下進行細胞收穫操作，且收穫的細胞滿足幹細胞的基本生物學質量要求。
目前市場上銷售的商業化微載體，絕大多數是以收穫細胞表達產物為目標，不能滿足細胞治療企業以收穫質量穩定、符合臨床應用需求的細胞的目的。華龕生物的3D明膠微載片（3DTableTrix）是一款多孔微載體，其核心成分為動物源蛋白與交聯劑固固化成外形為100-200 m 的多孔微球。微載體原材料選用藥用輔料級別並完成了第三方質量檢測及安全性評價，3D TableTrix微載片獲得了國家藥品審評中心（CDE）藥用輔料資質備案（F20210000003與F20210000496），同時也完成了美國FDA/DMF藥用輔料資質備案（DMF：35481）。
定製化3DTableTrix微載體的基本特性
2
基於3D微載體的幹細胞大規模製備工藝流程
選擇了合適的生物反應器和微載體，細胞製備企業還應根據自身情況（細胞型別、細胞庫、細胞質量控制節點、細胞終產品劑型以及臨床適應症等因素），建立適合企業自身的幹細胞大規模生產製備工藝。
下面，我們以臍帶間充質幹細胞（UC-MSCs）為代表，採用華龕3D TableTrix微載片，結合華龕3DFloTrix系列生物反應器，就基於3D微載體的大規模幹細胞製備工藝所需考慮的因素進行探討。
基於3D微載體的幹細胞大規模製備工藝流程
2D培養與3D培養的銜接
MSCs產品的生產工藝是從供者體內獲取組織，經組織分離、克隆培養而形成均一的細胞群體，經質量鑑定符合間充質幹細胞基本生物學特性的條件下建立原始細胞庫/種子庫（Primary Cell Bank，PCB）。
我們建議原始細胞庫階段仍採用傳統的二維培養工藝，採用經全面質檢合格的P2/P3代MSCs作為3D細胞培養工藝的種子細胞，接種到微載體上進行三維擴增培養。在接種起始細胞密度較低的情況下，可以選擇較小規模的生物反應器（如：125ml/500ml 3D FloTrix miniSPIN 灌流式生物反應器），隨著細胞擴增數量的增加，進而逐級放大到中試規模（5L 3D FloTrix vivaSPIN 自動化生物反應器）及生產規模（10L/15L 3D FloTrix vivaSPIN-VS自動化生物反應器）進行幹細胞製備。
此外，細胞接種在微載體上還應考慮以下影響因素：
採用新鮮製備細胞還是凍存細胞進行接種；
微載體接種前是否需要經過稱量、滅菌、溶脹等操作過程，經過這些操作過程的微載體如何進行質量控制；
細胞接種粘附到微載體上是靜態接種，還是微載體懸浮攪拌過程中動態接種，如何保證細胞在微載體上的接種效率。
不同規模生物反應器的的起始引數設定（轉速、溶氧、pH、通氣量等）；
種子細胞製備所採用的培養基在三維擴增工藝中是否適用等。
華龕3D微載體細胞接種工藝
連續動態擴增培養
MSCs在不同規格的生物反應器中進行連續動態擴增培養時，應考慮隨著細胞培養規模逐級放大，如何保證細胞的穩定生長。
應根據細胞常規指標（細胞密度、生長速率、活率、細胞倍增時間等），裝置的關鍵控制引數（溫度、DO、pH、攪拌速度和通氣流量等）來設定個體化的幹細胞擴增工藝引數，包括：
細胞在不同規模體系中的起始接種密度及培養的時間；
細胞如何從微載體上收穫並轉移到新的體系中；
細胞是連續逐級擴增放大最終形成工作細胞庫，還是在某個三維擴增體系節點建立主細胞庫，進而再放大到工作細胞庫；
培養基換液時間節點、如何在不損失細胞的情況下進行換液；
如何界定細胞代次；
在幹細胞大規模擴增時如何監測細胞的增殖狀況和質量，經三維擴增培養的細胞質量檢驗專案及標準如何設定。
根據不同組織來源的MSCs生長特性，華龕生物可定製化設計幹細胞三維擴增培養工藝引數，不僅滿足擴細胞數量的需求，更能滿足細胞的質量（基本生物學屬性、微生物學安全性、生物學安全性及生物學有效性等）；細胞質量達到《幹細胞製劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）2015》中關於幹細胞製劑的質量控制標準，所有三維擴增工藝引數均經過反覆驗證以保證不同型別幹細胞製備工藝的穩定性。
個體化的幹細胞三維擴增工藝流程方案設計
細胞收穫和凍存
微載體能夠顯著提高細胞擴增數量，但並不建議為了追求細胞數量而在微載體上長時間培養。原因在於幹細胞在培養過程中不斷分泌各種黏附因子，微載體容易聚團。在細胞收穫過程中，如果採用胰酶長時間消化細胞，將損傷幹細胞的表面標記物，影響細胞活力，最終影響幹細胞質量。
因此，如何將細胞從微載體上解離下來，又能保證細胞治療產品的高質量，是幹細胞大規模擴增工藝所必需考慮的問題。華龕生物針對3D TableTrix微載片開發的微載體裂解液（3DFloTrixDigest微載體裂解液），特異降解微載體材料，可實現全部幹細胞的高效、溫和收穫，避免了傳統胰酶消化液對幹細胞的損傷。透過常規簡單的清洗工藝，去除有害物質殘留，符合幹細胞製劑終產品的質量標準與安全性要求。
幹細胞經過生物反應器的擴增培養，可一次性製備多達10*10-10*12個細胞。如何在短時間內同時收穫大量細胞，這對於傳統的人工收穫和凍存工藝是一個嚴峻的挑戰。華龕生物正在開發與其生物反應器配套的幹細胞自動化收穫裝置以解決這一問題。
此外，經微載體連續擴增後的3D幹細胞微組織（幹細胞+微載體）亦可實現原位冷凍儲存，便於儲存、運輸和臨床應用。微組織凍存與復甦後仍保持幹細胞活性、功能及3D結構。復甦後的微組織既可以作為下一批幹細胞製備工藝的“種子”繼續連續擴增，同時也可以作為新型的3D幹細胞微組織創新藥物進行原位注射再生治療。
3D幹細胞微組織原位凍存後細胞特性
3
文末小結
生物反應器製備工藝，不僅能滿足細胞療法在臨床應用中對細胞數量和重量的需求，同時能夠顯著降低製備過程中耗材、人力、時間成本，也能保證細胞終產品的質量均一性，降低批次間差異。
但無論採用何種生物反應器和微載體進行幹細胞大規模製備，不能片面追求細胞數量，均應以細胞的關鍵質量屬性及工藝的穩定性作為評價標準。
在下篇，我們將就
基於3D微載體大規模擴增工藝的幹細胞質量控制及其產品的安全性
進行詳細討論。
— END —
幹細胞者說
- 科普 情懷 責任 -