光緒帝一生都操控在慈禧太后的手中，儘管他心懷大志，但卻因為各種實際的原因並未成功。在後來甲午中日戰爭之後，這位可悲的帝王認識到，要是想要不被外人欺負 ，能夠一雪前恥，必然要進行革新，以此來增強國家實力。可是此次革新雖然轟轟烈烈的展開了，但是卻遭到了以慈禧太后為首的頑固舊勢力的抵抗阻撓，所以最後只進行了 一百零三天便結束了。而光緒帝在此之後，便被慈禧太后幽禁在瀛臺，最後暴死。因為他死的突然，而且還是與慈禧太后相隔一天而死的，所以外界對於他的死因眾說紛紜。
在2008年以前，經各類檔案，以及史料記載，學者們推測認為是患病而死。民國之後，據光緒帝的御醫透露，皇帝生前的確身體並不非常健康，主因是不見天日、身體欠 運動、心情不佳導致飲食不正常。可是因為許多野史、宮廷回憶錄包括溥儀均指出光緒帝是被人下毒所害，所以也存在著被人毒死的說法。但在2008年以前，光緒帝是病死的 是主流觀點。
2008年以後，隨著現代技術的不斷髮展，科學研究院的人們，對光緒帝的骨頭頭髮衣服等進行了化驗，得出了驚人的結果。專家發現，光緒的衣領部位及頭髮上均沾染有 高濃度的三氧化二砷（即砒霜），其袍服胃區的三氧化二砷源於屍體腐敗時的體液浸蝕所致，而頭髮及衣領的三氧化二砷也是屍液浸蝕的遺留。常人口服砒霜60至200毫克就 會中毒身亡。而僅在光緒帝部分衣物和頭髮上檢出的砒霜總量就已高達約201毫克。最終判定，光緒帝的死因為：“急性腸胃型砒霜中毒”。
隨著死亡原因的真相大白，另一重迷霧卻接踵而來。既然光緒帝是中毒身亡，那麼到底是誰那麼大膽，竟然敢向一國之君投毒呢？對這個兇手，學者們各持各的觀點，給 出了很多種答案。
第一個懷疑物件，當仁不讓的就是那位大名鼎鼎的慈禧太后。畢竟看慈禧太后對待光緒帝的態度，只做傀儡，而無絲毫感情，後來更是囚禁了光緒帝。既然是她下令囚禁 了光緒帝，那麼把守之人皆為她的親信，要毒死光緒帝，她有動機，也有手段可能。據《崇陵傳信錄》和《清稗類鈔》兩本書指出：“慈禧太后病危期間，曾猶豫對光緒帝要 如何處置，遂以自己不久人世的訊息透露給光緒帝知道，惟其近侍回報，帝曾微露喜色”
慈禧太后怕自己死後，光緒帝翻案，因此想要在自己死前，解決掉光緒帝，斷絕可能。清室後裔、書法家啟功指出，其曾祖父、時任禮部尚書的溥良曾親眼看到太監從病 重的慈禧宮中傳出一個蓋碗，稱“是老佛爺賞給萬歲爺的塌喇”。而在這位“塌喇”送去不久，本無大病的光緒帝卻駕崩了。
第二個可疑人選，就是那個在光緒帝維新變法之際，背叛光緒帝的袁世凱。因為他的背叛，另光緒帝徹底的怨恨上了他。光緒帝被囚禁在瀛臺之時，“日書項城（指袁） 名以志其憤”。袁世凱自然知道光緒帝對自己的痛恨，如今太后彌留之際。若是太后去世，光緒帝自然就翻了身，到時候絕對不會放過他，所以才鋌而走險，出此下策。不過 此種說法，也有人提出異議。畢竟當時袁世凱已經被開缺回籍，遠在河南安陽。且按照清宮內廷制度，任何從宮外送入御用的食物必須先經人試毒。因此即使袁有動機，也不 大可能有機會對光緒帝下毒手。袁更不可能在有機會篡改清實錄和脈檔，製造光緒帝病死的假象。所以最大的可能，其實還是慈禧太后毒死了光緒帝。