內容來源：生物世界
嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）免疫療法是近年來快速發展的一種新型腫瘤治療方法。嵌合抗原受體（CAR）是透過細胞工程手段，在 T 細胞表面表達抗原受體蛋白，並能結合特定腫瘤抗原，啟用T細胞的腫瘤殺傷效能，實現細胞免疫治療的目的。
CAR-T 細胞免疫療法在針對CD19+B細胞惡性腫瘤的治療中取得了顯著療效，已被美國FDA和歐洲藥品管理局批准用於治療特定適應症。日前，國家藥品監督管理局也已批准了兩款CAR-T細胞治療產品於國內上市。
然而，作為一種新興的腫瘤治療手段，
CAR-T細胞免疫療法仍然受制於明顯的安全性問題
，這主要是由於缺乏對T 細胞活性定量、定時、定點地精準操控。例如，在半數以上接受治療的患者中，CAR-T細胞免疫治療會引起細胞因子釋放綜合徵、神經毒性或者對健康細胞存在“在靶/脫腫瘤”的細胞毒性。因此，
開發一種能夠對CAR-T細胞在時間和空間上精準操控的方法，對於實現安全精準的細胞免疫治療至關重要
。
2021年10月25日，美國得州農工大學
周育斌
教授團隊、
黃韻
教授團隊與麻省大學醫學院
韓綱
教授團隊合作，在
Nature
子刊
Nature Nanotechnology
線上發表了題為：Nano-optogenetic engineering of CAR T cells for precision immunotherapy with enhanced safety的研究論文。
這一突破性創新研究成果，
利用奈米光遺傳學技術實時體外無線操控光敏感嵌合抗原受體T細胞
（LiCAR-T）
，實現了安全精準的細胞免疫療法
。
圖： LiCAR-T細胞實現安全可控的細胞免疫療法
為了實現對CAR-T細胞的時空精準操控，得州農工大學周育斌教授團隊與麻省大學醫學院韓綱教授團隊及得州農工大學黃韻教授團隊合作，開發了一種基於奈米光遺傳學技術的紅外光無線操控手段，對CAR-T細胞進行可控啟用，實現了安全精準的細胞免疫療法。
奈米光遺傳學技術
是將
奈米光子學
與
光遺傳學技術
相結合，利用奈米材料作為原位光轉換器，將長波長激發光轉換為可啟用特定離子通道的刺激，如短波長可見光或熱刺激等，透過對離子通道的無線啟用，引發特定細胞行為。
該合作研究團隊在奈米光遺傳學領域具有深厚的技術積累。早在2015年，該合作團隊利用上轉換奈米顆粒將紅外光轉換為藍光，啟用樹突狀細胞的鈣離子通道，實現了對樹突狀細胞下游免疫反應的無線操控。此後，該合作團隊又相繼實現了利用奈米光遺傳學技術無線操控細胞壞死性凋亡和細胞焦亡用於腫瘤治療，以及奈米光遺傳學技術無線操控光敏蛋白用於可控免疫治療。此前的研究為這項工作積累了可靠的技術和具有創新精神的合作團隊。
圖：近紅外光啟用的奈米光遺傳學技術
在這項工作中，研究人員
首先對CAR-T 細胞進行了工程化改造
。研究人員將嵌合抗原受體功能區塊拆分成兩個模組，並在兩個模組上分別安裝光控元件。光控元件在藍光激發下，將兩個模組合併成一個完整的功能性嵌合抗原受體。
與傳統CAR-T細胞直接被特定抗原啟用相比，LiCAR-T細胞與特定抗原結合後並不會被啟用，而是在藍光的激發下，可控地啟用T細胞，從而實現時空精準操控的目的。研究人員嘗試了兩組植物來源的光控二元異聚元件（擬南芥來源的花隱色素 2 （CRY2）/CIBN組合及燕麥來源的 light-oxygen-voltage domain 2 （LOV2）-ssrA/sspB組合）。透過一系列在細胞水平對LiCAR-T細胞的光啟用功能性及暗毒性的評價，研究人員最終選擇了光啟用效率更高、暗毒性更低的基於燕麥LOV2元件的LiCAR-T細胞。
在驗證可控免疫治療的體外實驗中，研究人員利用人源外周血單核細胞（PBMC）的 CD8+T 細胞為基礎，設計表達了具有光控元件的LiCAR-T細胞，並發現LiCAR-T細胞在藍光的啟用下，表現出與傳統CAR-T細胞相當的對特異抗原表達的腫瘤細胞的殺傷效果。而在無藍光照射的條件下，LiCAR-T細胞並未被啟用。而對於無特異抗原表達的腫瘤細胞，無論光照與否，LiCAR-T細胞均未被啟用。
這些結果證實，LiCAR T 細胞能夠在腫瘤抗原和光照的雙重啟用條件下，對腫瘤細胞產生特異且嚴格可控的免疫治療反應。為了在同源小鼠腫瘤模型上驗證LiCAR-T細胞的可控免疫治療，研究人員利用小鼠的CD8+T 細胞為基礎，設計表達了LiCAR-T細胞， 並獲得了與基於人源CD8+T的LiCAR-T細胞一致的實驗結果。
圖：新型上轉換奈米顆粒具有顯著增強的紅外光-藍光轉換能力以及生物組織穿透力（高達釐米級）
然而，
單獨的LiCAR-T細胞並不能直接用於對深組織腫瘤的治療
。這是由於目前的光控元件大多對藍光等短波長可見光響應，而短波長可見光的組織穿透能力極弱（小於1-2毫米只能透過面板表皮層），無法從體外直接操控組織深處的光敏元件。為了解決這一普遍存在的問題，研究人員巧妙地
將上轉換奈米顆粒與LiCAR-T細胞結合起來，實現了無線操控的奈米光遺傳學技術
。上轉換奈米顆粒是一類特殊的熒光奈米材料，它能在長波長近紅外光的激發下產生反斯托克斯位移的短波長可見光。研究人員利用上轉換奈米顆粒作為原位光轉換器，將近紅外激發光轉換為藍光，啟用LiCAR-T細胞。這一方法解決了傳統光遺傳學工具受制於組織穿透深度淺的可見光激發的缺點，能夠實現無線操控的奈米光遺傳學技術。
研究人員首先構建了CD19陽性的B16-OVA-hCD19和CD19陰性的B16-OVA小鼠腫瘤模型。待腫瘤形成後，分別在腫瘤部位注射上轉換奈米顆粒和LiCAR-T細胞。為了提高上轉換奈米顆粒的發光效能，研究人員合成了高濃度Yb3+摻雜的大尺寸NaYbF4：0。5%Tm@NaYF4上轉換奈米盤（底部直徑約200 nm，高度約85 nm）。透過提高Yb3+的摻雜濃度及增迦納米顆粒尺寸，該上轉換奈米盤的發光強度，相對於傳統的30 nm粒徑NaYF4：30%Yb，0。5%Tm@NaYF4奈米顆粒，提高了約4。5倍。
研究人員利用二氧化矽包覆提高其生物相容性，並透過一系列組織切片及血液分析，驗證了其在小鼠體內的生物安全性及材料穩定性。在980 nm波長的紅外光照射下，該上轉換奈米盤發出藍光，原位啟用LiCAR-T細胞，對小鼠CD19陽性腫瘤細胞具有高效的殺傷效果，並消除了腫瘤；而在無光照或CD19陰性的條件下，LiCAR-T細胞不具有腫瘤殺傷效果。
在瘤內注射的基礎上，研究人員還研究了靜脈注射LiCAR-T細胞，配合瘤內注射上轉換奈米顆粒或將上轉換奈米顆粒偶聯至LiCAR-T細胞共同靜脈注射，利用紅外光可控啟用免疫反應，實現了對小鼠腫瘤的有效抑制。透過對照兩種注射方法，研究人員還發現，相比於分別注射的上轉換奈米顆粒和LiCAR-T細胞，偶聯後的上轉換奈米顆粒-LiCAR-T細胞呈現出對腫瘤的更優的抑制效果。這是由於偶聯後，上轉換奈米顆粒與LiCAR-T細胞距離更近，能夠實現更有效的近紅外光無線啟用。
圖：靜脈注射上轉換奈米顆粒偶聯的LiCAR-T細胞實現了利用光遺傳學技術無線操控的免疫療法對腫瘤的有效抑制
然後，研究人員驗證了LiCAR-T細胞能夠有效避免傳統CAR-T細胞免疫療法的副作用，特別是“在靶/脫腫瘤” 細胞毒性及細胞因子釋放綜合徵。在研究LiCAR T細胞的“在靶/脫腫瘤”細胞毒性時，研究人員發現LiCAR-T細胞僅抑制CD19陽性腫瘤細胞，而對於CD19陰性腫瘤細胞無影響，這驗證了其“在靶”效應。而常規CAR-T細胞“脫腫瘤”的細胞毒性常表現為引起具有CD19表達的 B 細胞發育不全。為了驗證LiCAR-T細胞能有效避免“脫腫瘤”細胞毒性，研究人員比較了LiCAR-T細胞/常規CAR-T細胞注射前後小鼠外周血中B細胞的數量。
結果表明，常規CAR-T細胞注射三天後，外周血中B細胞數量及B細胞百分比均有顯著下降，而LiCAR-T細胞注射並未引起B細胞數量及百分比的顯著變化。這些結果表明，LiCAR-T細胞能夠有效避免“在靶/脫腫瘤” 的細胞毒性。在比較LiCAR-T細胞與常規CAR-T細胞引發不受控免疫反應及相關細胞因子釋放綜合徵時，研究人員發現，注射常規CAR-T細胞三天後，CRS模型小鼠的體重明顯減輕，且伴有較高的IL-6細胞因子水平；而LiCAR-T細胞能有效避免這些不良反應。這些結果證實了LiCAR-T細胞能夠實現更加安全可控的細胞免疫療法。
綜上，
該交叉研究利用獨特的奈米光遺傳學技術操控LiCAR-T細胞，實現了時空精準操控的細胞免疫療法
。同時，與上轉換奈米顆粒結合使用，利用近紅外光實現無線操控的深組織啟用，能夠避免傳統光遺傳學技術組織穿透能力差的缺點。上述上轉換/LiCAR-T細胞免疫療法能夠有效避免傳統CAR-T細胞免疫療法中“在靶/脫腫瘤” 細胞毒性及細胞因子釋放綜合徵等副作用，顯著提高了細胞免疫療法的安全性。這種可遠端控制的奈米光遺傳學技術不僅將為研究嵌合抗原介導的抗腫瘤免疫提供獨特的研究手段，還為開發智慧免疫療法以提供個性化抗癌奠定了基礎。
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